鼠肺血管内皮细胞的分离与培养方法

　　小鼠肺血管内皮细胞（PECs）是肺部血管的关键组成部分，对肺循环的稳定和气体交换功能具有重要作用。研究肺血管内皮细胞有助于了解肺部疾病的机制，如肺动脉高压、肺水肿及其它血管相关疾病。本文简要介绍了小鼠肺血管内皮细胞的分离与培养方法。

　　一、材料与设备

　　1.动物模型：健康C57BL/6小鼠（8-12周龄，雄性或雌性均可）

　　2.细胞培养基：EndothelialCellMedium（ECM），或含有10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素（青霉素/链霉素）的DMEM/F-12混合培养基

　　3.试剂与工：胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）、含胶原酶和DNA酶的消化液、离心管、培养皿、无菌操作台

　　二、小鼠肺血管内皮细胞的分离步骤

　　1.动物麻醉与处死：使用异氟烷麻醉小鼠，通过颈部脱臼处死。之后迅速将小鼠胸腔暴露，并剪开胸腔，暴露出双侧肺脏。

　　2.肺脏灌注：在肺动脉处插入针头，通过心脏将1×PBS缓冲液注入肺脏，进行灌注清洗，去除肺脏表面的血液。此步骤有助于减少血液中的红细胞对细胞分离的干扰。

　　3.肺组织消化：将灌注清洗后的肺组织剪碎，放入含有胶原酶（1mg/mL）和DNA酶（20U/mL）的消化液中，37℃下消化30-45分钟。消化过程中轻轻吹打以促进组织分解。

　　4.细胞过滤与收集：消化后，将细胞悬液通过70μm细胞过滤网过滤，去除未完全消化的组织块。收集滤液，加入PBS进行多次离心洗涤（500×g，5分钟），去除消化液和杂质。

　　5.细胞培养：将分离得到的细胞重新悬浮在培养基中，并接种于培养皿（T25或更大培养瓶）。使用含10%FBS的ECM培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

　　三、小鼠肺血管内皮细胞的鉴定

　　1.形态观察：在培养初期，血管内皮细胞呈典型的多角形或长梭形，生长为单层铺展的细胞。

　　2.免疫荧光染色：使用血管内皮细胞特异性标志物进行鉴定，如抗-CD31、抗-VE-cadherin、抗-vWF抗体。通过免疫荧光染色和显微镜观察，验证细胞为内皮细胞。

　　3.功能鉴定：细胞形成的血管样结构、白细胞黏附、流动性测试等也可作为功能鉴定方法。

　　四、培养注意事项

　　1.培养环境：维持细胞在37℃、5%CO₂环境下生长。定期更换培养基，通常每2-3天一次，确保细胞的营养供给。

　　2.细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时，可用0.25%胰蛋白酶处理进行传代。传代时应尽量避免过度操作，保持细胞的良好状态。

　　3.污染控制：在整个操作过程中，严格遵守无菌操作，防止细菌、真菌等污染，影响细胞的生长与实验结果。

　　小鼠肺血管内皮细胞的分离与培养技术是研究肺血管生理及病理的基础方法。通过适当的灌注、消化和细胞分离手段，可以获得纯度较高的肺血管内皮细胞，为相关疾病模型的建立及药物筛选提供了重要的实验平台。在实际应用中，细胞培养环境和操作细节对实验结果至关重要，需谨慎操作与优化。